E3Switch DE3 Bedienungsanleitung

Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Substratspezifität der R

4 I.4 Struktur der Rho-Proteine Die Rho-GTPasen sind monomere Proteine mit einer molaren Masse von 20-30 kDa (Abb. A4). Ihre Struktur weist zwei fle

5 carboxymethyliert (Abb. A5). Der Isoprenrest ist eine wichtige Vorraussetzung für viele Funktionen der Rho-GTPasen, da er für die

6 zur vermehrten Bildung von Aktin-Kabeln, die das gesamte Zytoplasma durchziehen. Rho-Proteine fördern nicht nur die Bildung, sondern auch

7 Profilin und trägt auf diesem Weg zur Aktin-Kabel-Bildung bei (Alberts, 2001). Ein anderer Weg, über den RhoA die Bildung von Aktin-Kabeln

8 I.9 Wirkungsmechanismus von Rac am Zytoskelett Aktiviertes Rac bewirkt in Kulturzellen die Bildung von Lamellipodien, breiten Zellausstül

9 I.10 Nicht-Zytoskelett-assoziierte Funktionen Außer an der Regulation des Zytoskeletts sind die Rho-GTPasen an der Regulation der Tran

10 Außerdem können die Rho-Isoformen sequentiell oder kompensatorisch (Simpson, 2004) zusammen wirken. Zur kaskadenartigen Aktivierung

11 II Bakterielle Toxine II.1 Einteilung Die Einteilung bakterieller Toxine erfolgt in Endotoxine und Exotoxine. Endotoxine werden beim Zerfall

12 Dementsprechend sind diese Toxine grundsätzlich aus zwei Komponenten aufgebaut, einer A- und einer B-Komponente (Abb. A10). Die B-Komponent

13 Eine Reihe von Exotoxinen hat sich auf die Modifikation der Rho-GTPasen spezialisiert. Diese Toxine lassen sich unterteilen in solche,

Dekan: Prof. Dr. C. Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. med. rer. nat. K. Aktories 2. Gutachter: Prof. Dr. H

14 Rho-inaktivierende Toxine C3-Exoenzyme Clostridium botulinum C3-ADP-Ribosyltransferase (verschiedene Isoformen) Clostridium limosum Transfrase S

15 II.4 Rho-aktivierende Toxine CNF („Cytotoxic necrotizing factor“) E. coli Bakterien sind physiologische Bewohner des Darmtraktes und kö

16 das als Substrat von CNF1 nachgewiesen werden konnte, erstreckt sich von Aminosäure 59 bis 69 von RhoA (Flatau, 2000). DNT („Dermonecrotic Toxin

17 II.5 Transglutaminasen Transglutaminasen katalysieren die posttranslationale Modifikation von Proteinen durch Transglutaminierung. Dabei

18 (Knight, 1991; Nicholas, 2003). Nach Stimulation durch Retinolsäure aktiviert die Gewebstransglutaminase RhoA durch Transglutaminieru

19 Die bakteriellen Toxine, die die Rho-GTPasen modifizieren, haben den Rho-Isoformen gegenüber alle eine unterschiedliche Substratspezifit

20 B Zielsetzung Ziel der Arbeit ist es, die Substratspezifität der Rho-aktivierenden Toxinen CNF1 und DNT sowie der Gewebstransglutaminase für di

21 C Material und Methoden I Material I.1 Puffer, Nährmedien und Antibiotika Alle Puffer und Medien wurden mit Aqua bidest. angesetzt und autok

22 Waschpuffer 50 mM Hepes pH 7,4 150 mM NaCl 2 mM MgCl2 Glutathion-Elutionspuffer 10 mM reduziertes Glutathion 50 mM Tris/HCl pH 8,0 100 mM NaCl

23 P2*-Puffer 1 NADH-Tablette (ca. 0,4 mg NADH) gelöst in 4 ml Lösung aus Flasche 1 (Triethanolaminpuffer pH 8,0 und 2-Oxoglutarat) Puffer A 50

Danksagung An dieser Stelle möchte ich Prof. Dr. Dr. Aktories für die Überlassung des Themas, die hervorragenden Arbeitsbedingungen u

24 10 x Pfu-Polymerase-Puffer 200 mM Tris/HCl pH 8,8 20 mM MgSO4 100 mM KCl 100 mM (NH4)2SO4 1% Triton X-100 1 mg/ml BSA I.2 Bakterienstämme Bakte

25 Radioaktive Lösungen 200 µM [γ−35S] GTP-Lösung Aqua bidest. ad 200 µl 4 µl 10 µM unmarkiertes GTP (final: 200 µM) 1 µl [γ−35S] GTP-Stammlösung 20

26 I.9 Firmen Alle weiteren Chemikalien wurden in der notwendigen Reinheit von folgenden Herstellern bezogen: Boehringer, Mannheim DIFCO Laborat

27 Ultraschall-Pulser “Sonopuls HD 60”, Bandelin, Berlin Netzgerät Power Pac 3000, BioRad, München Blotapparatur Semi-Dry Transfer Cell, Biorad, Mü

28 RhoG RhoG E63D sense GGGCCAGGAGGACTATGACCGCCTCC RhoG E63D antisense GGAGGCGGTCATAGTCCTCCTGGCCC RhoG T69P sense GACCGCCTCCGTCCACTCTCCTACC RhoG

29 II Methoden II.1 Arbeiten mit Proteinen Alle Arbeiten mit Proteinen wurden soweit möglich auf Eis durchgeführt, und die aufgereinig

30 Die Hauptkultur wurde zunächst bei 37°C im Schüttler bis zu einer optischen Dichte von 0,7-1,0 (λ=600 nm) wachsen gelassen. Dann wurde dur

31 nacheinander 50 ml Waschpuffer und 5 ml Glutathion-Elutionspuffer gegeben. Das Eluat wurde in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen aufgefangen und b

32 Die Absorption der Proteinlösung wurde photometrisch bei 595 nm gegen einen Nullwert gemessen und die Proteinkonzentration über folgen

33 Protein-Marker 1. peqGOLD Protein-Marker Protein Herkunft Molekulargewicht (kDa) β-Galaktosidase E. coli 116.0 Bovines Serum-Albumin Rinders

INHALTSVERZEICHNIS____________________________________________________I A Einleitung 1 I Rho-GTPasen 1 I.

34 2 Polyacrylamidgele Sammelgel 5% (ml) Trenngel 12,5% (ml) H2O 2,020 0,480 0,75 M TRIS pH 8,8 3,750 0,625 M TRIS pH 6,8 0,660 30

35 Nachweisreaktion. Bei der Nachweisreaktion kommt es zu einer Lichtemission, die auf einem Film festgehalten wird (Abb. C1). Abb. C1: Prinzip des

36 II.2 Tests der Substratspezifität 2.1 Auswahl der Konzentrationen für die Reaktionsansätze In dieser Arbeit ging es um die Frage, ob ei

37 Ein Ansatz enthielt Protein und Toxin im Verhältnis von ∆DNT : GTPase  1 : 2 CNF1full length : GTPase  1 : 10 tTG (1µg/µ

38 2.3 Messung der Ammoniakfreisetzung Die Deamidierung der Rho-Proteine wurde anhand einer gekoppelten enzymatischen Reaktion mit Hilfe

39 Reaktionsphase. Das Toxin wurde direkt in die Küvette gegeben und der Ansatz durch Invertieren der Küvette gemischt. Die Proben wur

40 Die Inkubationszeit betrug 3 Stunden, die Inkubationstemperatur 37 °C. Die Reaktion wurde mit Probenpuffer gestoppt und die Proben für fünf Minut

41 Die Berechnung des beladenen Anteils: 1 µg GTPase entspricht einer Menge von ca. 50 pmol GTPase 1 µl 200 µM [γ−35S]GTP entspricht einer Menge vo

42 Für die Beladung mit [γ−32P]GTP wurde die GTPase 5 Minuten lang mit EDTA (10 mM) und DTT (2 mM) bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von unmarkierte

43 Für die zielgerichtete Mutagenese werden zwei komplementäre Primer verwendet, die die erwünschte Mutation enthalten. In einer Mutagenes

INHALTSVERZEICHNIS___________________________________________________II II Methoden 29 II.1 Arbeiten mit Proteinen 2

44 Lösung vorhanden sind. Auf diese Weise konnte Plasmid-DNA von guter Qualität identifiziert und für die Versuche verwendet werden. 3.5

45 trägt, nicht methyliert ist. Dpn1 schneidet spezifisch methylierte DNA an der Zielsequenz 5’Gm6AC-3’. 1 µl Dpn1 (10 U/µl) wurde

46 Die natürliche Kompetenz von E. coli ist gering und wird durch die folgende Methode erheblich gesteigert: Aus 5 ml einer Übernachtku

47 Ein PCR-Ansatz mit einer DNA-Polymerase, einem pGEX-Primer, den vier Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP) und vier durch unterschiedlic

48 Ampli Taq DNA Polymerase, FS MgCl2 Tris/HCl pH 9,0 Markierte DdNTP’s (Dye Terminatoren) Name Bezeichnung DdATP R6G (N,N’-diethyl-2’,7’-d

49 D Ergebnisse Ziel der Arbeit war es, die Substratspezifität der Rho-aktivierenden Toxine CNF1 und DNT sowie der Gewebstransglutaminase gegenüb

50 I Nachweis der korrekten Faltung der getesteten Rho-Proteine Bevor Aussagen darüber gemacht werden können, ob ein rekombinantes Prote

51 II DNT und CNF1 II.1 Substratspezifität von DNT Das Rho-aktivierende Toxin DNT besitzt eine größere Transglutaminierungsaktivität als D

52 RhoD, RhoG (Abb. D3): Die GTPasen RhoD und RhoG werden nicht von DNT transglutaminiert. Auch das nicht zur Rho-Familie gehören

53 II.2 Substratspezifität von CNF1 CNF1 aktiviert wie DNT die Rho-Proteine durch Modifikation an Glutamin 63 (Flatau, 1997; Schmidt, 1997). Es bewi

INHALTSVERZEICHNIS__________________________________________________III D Ergebnisse 49 I Nachweis der korrekten Faltung der

54 RhoA, Cdc42, Rac1, TC10 (Abb. D4): Die Deamidierung von RhoA, Cdc42, Rac1 und TC10 wurde durch die Bestimmung der Ammoniakfreisetzung

55 RhoC, RhoB, RhoG und RhoD (Abb. D5): Auch die Deamidierung von RhoC, RhoB und RhoG wurde nachgewiesen. Sowohl an den Absorbtionskurven der Prob

56 Tabelle D2 zeigt eine Übersicht der Ergebnisse der Bestimmung der Ammoniakfreisetzung. GTPase RhoA Cdc42 Rac1 TC10 RhoC RhoB RhoG RhoD

57 Prolin. Die Seitenkette von Threonin ist hydrophil, während die von Prolin neutral ist. Die dritte abweichende Aminosäure von RhoG ist das Aspara

58 II.5 Untersuchung der Mutanten RhoG-Mutanten Der Ausgangspunkt für die ersten Transglutaminierungsversuche war die Frage, ob die Amino

59 Abb. D8: Transglutaminierung durch CNF1 Kosubstrat: Monodansylcadaverin; der Versuch wurde zweimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt; R

60 Dass die Aminosäure 76 in RhoD bzw. 64 in RhoA auch für die Transglutaminierung durch DNT notwendig ist, wurde durch die nächsten Versuche mit DN

61 beweist dies, dass es im Falle der Deamidierung des getesteten Proteins zu einer Motilitätsänderung kommt. Dass die Aminosäure 64

62 Abb. D12: Deamidierung durch CNF1 Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel; der Versuch wurde dreimal mit gleichem Ergebnis durchgefüh

63 IV Gewebstransglutaminase IV.1 Substratspezifität der Gewebstransglutaminase Im Gegensatz zu Faktor XIII oder DNT gilt die Gewebstrans

1 A Einleitung I Rho-GTPasen I.1 Niedermolekulare GTP-bindende Proteine Rho-GTPasen sind niedermolekulare GTP-bindende Proteine, die zur

64 RhoD, RhoG, TC10 (Abb. D14): RhoG, RhoD und TC10 sind ebenfalls Substrate der Gewebstransglutaminase, werden aber im Vergleich zu RhoB und RhoC

65 Tabelle D4 zeigt eine Übersicht über die Ergebnisse der Transglutaminierungsversuche. GTPase RhoA Cdc42 Rac1 TC10 RhoC RhoB RhoG RhoD

66 Die Aminosäureseitenketten von Cdc42 unterscheiden sich also an Position 137 und 140 stärker von RhoA als an Position 139. Aus diesem

67 V Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse Tabelle D6 fasst die Ergebnisse der Versuche mit den Wildtyp Rho-GTPasen zusammen. GTPase RhoA

68 E Diskussion Der Zytotoxische Nekrotisierende Faktor 1 (CNF1) und das Dermonekrotische Toxin (DNT) sind zwei bakterielle Exotoxine, die von Esc

69 I DNT und CNF1 Substratspezifität Die Transglutaminierung der Rho-GTPasen wurde mit Hilfe des fluoreszierenden Kosubstrates Monodansylc

70 Alle in RhoA identifizierten Aminosäuren, die für die Transglutaminierung oder die Deamidierung durch DNT oder CNF1 von Bedeutung sind,

71 Abb. E3: Switch-II-Region von RhoA Die drei benachbarten Aminosäuren Gln 63, Glu 64 und Asp 65 sind dargestellt. Durch den Austausch von Glutam

72 Abb. E4: Aminosäuresequenz 59-78 von RhoA und RhoD D76E grau unterlegt: abweichende Aminosäuren; Transglutaminierung und Deamidierung unters

73 Rho-GTPase Switch-I-Region (As 32-41) Switch-II-Region (As 62-78) RhoA EVYVPTVFEN GQEDYDRLRPLSYPDTD RhoB EVYVPTVFEN GQEDYDRLRP

2 I.2 Gliederung der Rho-Familie Zur Rho-Familie gehören 22 Mitglieder, die in acht Subgruppen unterteilt werden können (Abb. A2) (Aspe

74 folglich durch Aminosäuren in Cdc42 verhindert werden, die nicht mit denen von RhoA übereinstimmen. GTPase Modifizierte Gln in Rho

75 Gewebstransglutaminase. In diesem Sinne lassen sich die Ergebnisse dieser Arbeit interpretieren. Obwohl die Region in RhoA, die d

76 ob es Substrat für andere bakterielle Toxine ist. Möglicherweise gibt es Parallelen zwischen verschiedenen Toxinen in Bezug auf die Bindung des S

77 F Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifität der bakteriellen Toxine CNF1, DNT und der eukaryoten Gewebstransg

78 G Literaturverzeichnis Aeschlimann, D. and V. Thomazy (2000). "Protein crosslinking in assembly and remodelling of extracellular matrices

79 Cooper, A. J., Sheu, K. F., Burke, J. R., Onodera, O., Strittmatter, W. J., Roses, A. D., Blass, J. P. (1997). "Polyglutamine domains are su

80 Gorman, J. J. and J. E. Folk (1981). "Structural features of glutamine substrates for transglutaminases. Specificities of human plasma facto

81 Khan, A. H. and J. E. Pessin (2002). "Insulin regulation of glucose uptake: a complex interplay of intracellular signalling pathways."

82 Matsuzawa, T., Kashimoto, T., Katahira, J., Horiguchi, Y. (2002). "Identification of a receptor-binding domain of Bordetella dermonecrotic t

83 Sanders, L. C., Matsumura, F., Bokoch, G. M., de Lanerolle, P. (1999). "Inhibition of myosin light chain kinase by p21-activated kinase.&qu

3 In der GDP-gebundenen Form liegen die GTPasen an GDIs („guanine nucleotide dissociation inhibitors“) gebunden im Zytoplasma vor (Ueda, 1990). Dies

84 H Anhang I Abbildungen Abb. H1: Alignment; Aminosäuresequenzen von RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, RhoG, Cdc42, T

85 II Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abb. A1: Stammbaum niedermolekularer GTP-bindender Proteine Abb. A2: Einteilung der Rho-Familie Abb. A3:

86 Tab. A1: Übersicht Rho-GTPasen modifizierende bakterielle Toxine Tab. D1: Transglutaminierung durch DNT – Übersicht Tab. D2: Deamidierung durch

87 V Abkürzungen Aqua bidest. Aqua bidestillatum APS Ammoniumpersulfat As Aminosäure ATP Adenosintriphosphat BTRRM

88 VI Lebenslauf Persönliche Daten Name: Ulrike Pack Wohnort: Draisstr. 4 79106 Freiburg Geburtsdatum: 07.09.1977 Geburtsort: Berli