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II.2 Substratspezifität von CNF1

CNF1 aktiviert wie DNT die Rho-Proteine durch Modifikation an Glutamin 63 (Flatau, 1997;

Schmidt, 1997). Es bewirkt die Aktivierung der GTPasen vornehmlich durch Deamidierung.

Außerdem besitzt es eine geringe Transglutaminierungsaktivität (Schmidt, 1998). Für die

Substraterkennung durch CNF1 ist eine Sequenz von 20 Aminosäuren ausreichend, die im

Prinzip der Switch-II-Region von RhoA entspricht (Asp 59 - Asp 78). Innerhalb dieser

Region sind Arginin 68 und Leucin 72 essentiell (Lerm, 1999a).

Die Deamidierung der Substrate kann anhand der Messung der Ammoniakfreisetzung

während der Inkubation mit CNF1 nachgewiesen werden. Der gemessene Ammoniak entsteht

bei der Deamidierungsreaktion durch den Austausch von NH

an Glutamin 63 gegen eine

Hydroxylgruppe. Gemessen wird die Absorption von NADH, die infolge einer gekoppelten

Reaktion, bei der NAD

aus NADH entsteht, proportional zur Ammoniakentstehung abnimmt.

Die Kinetik der Ammoniakentstehung lässt sich mit Hilfe der Regressionsgeraden der

Absorptionskurven darstellen. Die Regression ist die Steigung einer Gerade, die im annähernd

linear verlaufenden Anfangsbereich der Absorptionskurve durch die Messpunkte gelegt wird

und angibt, wie schnell bei der Reaktion Ammoniak entsteht. Im Folgenden werden die

Absorptionskurven der Reaktionsverläufe und deren Regressionsgeraden gezeigt.

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