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Die Hauptkultur wurde zunächst bei 37°C im Schüttler bis zu einer optischen Dichte von 0,7-

1,0 (λ=600 nm) wachsen gelassen. Dann wurde durch Zugabe von IPTG (0,2 mM) die

Expression des Proteins stimuliert. Die Expressionsbedingungen wurden für das jeweilige

Protein optimiert. Die Expressionszeit von RhoA, Rac1 und Cdc42 betrug 3 Stunden, die von

RhoB, RhoC, RalA, CNF1 und DNT 4 Stunden und die von RhoG, RhoD 5 Stunden.

Die Ernte der Kulturen erfolgte mit Hilfe einer 10-minütigen Zentrifugation bei 4°C mit 6000

rpm. Die Bakterienpellets wurden bei – 20 °C eingefroren.

1.1.2 Lyse der Bakterienzellen

Die Bakterienpellets wurden für die Lyse in 10 ml Lysispuffer pro Liter Kultur resuspendiert.

Dem Lysispuffer waren Proteaseinhibitoren und das Reduktionsmittel DTT zugesetzt.

Die Lyse der Bakterienzellen erfolgte entweder mit Hilfe einer „French Press“ (Lysispuffer

A) oder mit Hilfe von Ultraschall (3 x 1 min, 70 % Schalleistung, Lysispuffer B). In der

„French Press“ wird die Bakteriensuspension unter hohem Druck (50 bar) durch eine kleine

Öffnung gepresst und wieder aufgefangen. Durch den abrupten Wechsel von hohem zu

niedrigem Druck zerplatzen die Bakterienzellen.

1.1.3 Affinitätschromatographie mit Gluthation-Sepharose-Beads

Für die Affinitätschromatographie zur Isolierung des rekombinanten Proteins aus dem

Bakterienzelllysat wurden Glutathion-Sepharose-Beads verwendet. Diese perlenförmige

Matrix (engl. beads = Perlen), die immobilisiertes Glutathion trägt, bindet das GST-

Fusionsprotein. Für die Kopplung des Fusionsproteins an die Beads wurde das

Bakterienzelllysat bei 4°C und 12000 rpm 10 Minuten lang abzentrifugiert und der Überstand

1h lang bei 4°C mit Glutathion-Sepharose-Beads im Überkopfschüttler inkubiert.

1.1.4 Glutathion-Freisetzung

Bei der Glutathion-Freisetzung nutzt man die kompetitive Bindung von immobilisiertem und

gelöstem Glutathion an den GST-Anhang der rekombinanten Proteine, um die Proteine zu

eluieren. Die Glutathion-Freisetzung wurde auf zwei verschiedene Weisen durchgeführt.

Säulen-Elution

Bei größerem Bedarf an Protein bot sich die Elution über eine Säule an. Hierbei wurden die

Glutathion-Sepharose-Beads mit dem gebundenen Protein in eine Säule eingebracht, auf

deren Boden sich als Filter eine dünne Schicht Quarzwolle befand. Auf die Säule wurden

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