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E3Switch DE3 Bedienungsanleitung Seite 52

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46
Die natürliche Kompetenz von E. coli ist gering und wird durch die folgende Methode
erheblich gesteigert:
Aus 5 ml einer Übernachtkultur, angeimpft mit TG1 oder BL21 Zellen aus vorher auf gleiche
Weise hergestellten Glycerin-Kulturen, wurden 500 ml einer Hauptkultur hergestellt. Diese
wurde bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 0,3-0,5 bei 37°C und 200 rpm im
Schüttler inkubiert und anschließend 20 Minuten auf Eis a/jointfilesconvert/377385/bgekühlt. Die Zellen wurden 5
Minuten lang bei 12000 rpm pelletiert, um dann in TSS-Medium mit 10% Glycerin
resuspendiert zu werden.
Die Zellsuspension wurde auf Eis in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße aliquotiert und dann
bei -80°C eingefroren.
3.9 Transformation
Die Aufnahme der mutierten Plasmid-DNA in Bakterienzellen wird mit Hilfe eines
Hitzeschocks erreicht.
125 µl TG1 oder BL21 E. coli Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 2 µl der in der Mutagenese-
PCR amplifizierten Plasmid-DNA wurden hinzu gegeben und die Bakterienzellen dann
zunächst für 20 Minuten auf Eis bei 4°C belassen. Anschließend wurden die Proben für 90 s
bei 42°C inkubiert und danach für weitere 5 Minuten auf Eis gestellt.
Bevor die Zellen auf Agarplatten ausgestrichen wurden, wurden sie in 400 µl SOC-Medium
zur Vermehrung 1 Stunde bei 37°C im Schüttler inkubiert. Da auf dem pGEX-Vektorplasmid
ein Ampicillin-Resistenz-Gen kodiert ist, konnten auf den Agarplatten über Nacht nur
Bakterien wachsen, die das Plasmid besaßen.
Von den gewachsenen Kolonien wurden am nächsten Tag einige herausgepickt, auf eine
zweite Agarplatte („Masterplate“) aufgebracht und wieder über Nacht wachsen gelassen. Für
die DNA-Sequenzierung und alle weiteren Verwendungen wurden die Bakterien von der
Masterplate benutzt.
3.10 Kontrolle der Basensequenz
Jede Mutation, die im Rahmen dieser Arbeit vorgenommen wurde, wurde durch die
Bestimmung der Basensequenz bestätigt.
Die Sequenzierung der Plasmid-DNA geschah mit Hilfe des „ABI PRISM TM BigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits“ der Firma Perkin Elmer. Die Methode
basiert auf einer modifizierten Form der Kettenabbruchmethode, die von Sanger 1977
beschrieben wurde.
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Poskytujeme 1 manuály pdf Citizen CD-S501S ke stažení zdarma podle typů dokumentů: Uživatelský manuál


Citizen CD-S501S Uživatelský manuál (46 strany)


Značka: Citizen | Kategorie: Print & Scan | Velikost: 0.45 MB |

 

Tabulka s obsahem

Forschungsdatenzentrum

1

Jahresbericht 2013

1

Zusammenfassung

5

Inhaltsverzeichnis

7

Einleitung

9

1 Basisdaten

11

http://www.gesis.org/dbk

13

3 Performance

19

3.2 Projekttypen

20




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