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Die Inkubationszeit betrug 3 Stunden, die Inkubationstemperatur 37 °C. Die Reaktion wurde

mit Probenpuffer gestoppt und die Proben für fünf Minuten auf 95 °C erhitzt.

Die gekochten Proben wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 µl Jodacetamid (20

mg/100 µl H

O) pro 20 µl Probe inkubiert. Jodacetamid modifiziert freie SH-Gruppen durch

Alkylierung und verhindert die Bildung neuer Disulfidbrücken. Anschließend wurden die

Proben auf ein Harnstoffgel aufgetragen.

Als Marker wurde ein vorgefärbter Marker verwendet, mit dessen Hilfe der Lauf der

Proteinbanden im Gel beobachtet werden konnte. Der Lauf wurde erst gestoppt, wenn die

interessierende Bande möglichst weit gelaufen war, um einen deutlichen Shift zu erhalten.

2.5 Messung der GTP-Bindung

Die korrekte Faltung der Proteine wurde anhand der Bindung des radioaktiv markierten

[γ−

S]GTP nachgewiesen werden, einem Nukleotid, das aufgrund eines Schwefelatoms

anstelle eines Phosphorsauerstoffs an Position γ nicht mehr zu GDP hydrolysiert werden

kann. Die Bindung von [γ−

S]GTP an die Rho-GTPasen zeigt an, dass die Proteine in der

richtigen Tertiärstruktur vorliegen, also korrekt gefaltet sind.

Protein und [γ−

S]GTP wurden für die Beladung mit [γ−

S]GTP 90 Minuten lang bei 37°C

inkubiert und der Anstieg der Radioaktivität als Folge der [γ−

S]GTP-Bindung im

Zeitverlauf bestimmt. Für die Messung wurden die Proben nach 0, 5, 10, 30, 60 und 90

Minuten auf Filterpapiere gegeben, und freies [γ−

S]GTP wurde mit 20 ml Puffer A entfernt.

Jeder Ansatz enthielt pro Filter:

1µg GTPase

1 µl 100 mM DTT

1 µl 100 mM Mg

1-5 µl 200 µM [γ−

S]GTP-Lösung und

50 mM Tris/HCl pH 7,5 ad 50 µl.

Gemessen wurde die Radioaktivität der Filter im Szintillationszähler. Zur Verstärkung des

Signals wurden die Proben in Messgefäßen mit „High Flash-point LSC-cocktail“ gemessen.

Als Referenz wurde jeweils eine Probe von einem Mikroliter [γ−

S]GTP-Lösung gemessen,

so dass auf den Anteil beladenen Proteins vom Gesamtprotein rückgeschlossen werden

konnte.

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