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D Ergebnisse

Ziel der Arbeit war es, die Substratspezifität der Rho-aktivierenden Toxine CNF1 und DNT

sowie der Gewebstransglutaminase gegenüber verschiedenen Isoformen der Rho-GTPasen zu

untersuchen, und die biologischen Eigenschaften der drei Enzyme und der GTPasen genauer

zu beschreiben.

Um zu testen, ob eine GTPase das Substrat eines Toxins ist, kommen verschiedene

Nachweismethoden zum Einsatz. Die Transglutaminierung durch ein Toxin kann

nachgewiesen werden, indem für die Reaktion das fluoreszierende Kosubstrat

Monodansylcadaverin verwendet wird. Die Deamidierung von RhoA kann durch den

Nachweis einer Motilitätsänderung auf dem SDS-Gel nachgewiesen werden. Die

Deamidierung anderer Rho-GTPasen, wie Rac und Cdc42, führt nicht zu einer

Motilitätsänderung und wird am besten durch die Messung der Ammoniakfreisetzung

nachgewiesen.

Es wurden die Rho-GTPasen RhoA, Rac1, Cdc42, RhoB, RhoC, RhoG, RhoD und TC10

untersucht. Das Mitglied der Ras-Familie RalA wurde als Negativkontrolle der Rho-

spezifischen Toxine getestet. Für die Tests der Substratspezifität wurden sowohl die C-

terminalen Toxin-Fragmente ∆DNT (As 1136 -1451) und ∆CNF1 (As 709 -1014) als auch

das vollständige Toxin CNF

vollständig

verwendet. Die Toxin-Fragmente besitzen volle Aktivität.

Die Aminosäuresequenzen aller in dieser Arbeit verwendeten Rho-GTPasen sind in Abb. H1

im Anhang dargestellt.

Um für die Substratspezifität notwendige Aminosäuren zu identifizieren, wurde

folgendermaßen vorgegangen. Als erstes wurde die Substratspezifität von DNT, CNF1 und

der Gewebstransglutaminase für alle Rho-GTPasen mit Hilfe der Transglutaminierung mit

Monodansylcadaverin und der Bestimmung der Ammoniakfreisetzung ermittelt. Danach

wurde mit Hilfe von Aminosäuresequenzvergleich und gezieltem Austausch von

Aminosäuren untersucht, welche Aminosäuren für die Substratspezifität der drei Enzyme

entscheidend sind. Verglichen wurden die Aminosäuresequenzen von Rho-GTPasen, die

modifiziert werden mit denen, die nicht modifiziert werden. Das wichtigste Kriterium für die

Auswahl auszutauschender Aminosäuren war, dass diese Aminosäuren Seitenketten besitzen,

die sich in Eigenschaften wie Ladung, Polarität oder Länge voneinander unterscheiden. Ein

zweites Kriterium war die Nähe zum modifizierten Glutaminrest. Wenn nicht anders

angegeben, entspricht die Nummerierung der Aminosäuren der Nummerierung von RhoA.

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